Gentechnik: Bestimmung der Basensequenz

Gentechnik: Bestimmung der Basensequenz

 

Der Informationsgehalt einer DNA ist in der linearen Abfolge der einzelnen Basen beziehungsweise Basenpaare enthalten. Wenn es sich um einen proteincodierenden DNA-Abschnitt handelt, bestimmt die Basensequenz die Aminosäuresequenz und die Länge der Polypeptidkette. Aber auch für Abschnitte, die nicht für Proteine codieren, ist die Information in der Basensequenz enthalten. Dies gilt vor allem auch für regulatorische DNA-Elemente wie Promotoren, Enhancer-(Transkriptionsverstärker-)Elemente und so weiter. Sogar die Organisation wichtiger chromosomaler Domänen, wie zum Beispiel die für die Aufteilung der Chromosomen in der Kern- und Zellteilung wichtigen Centromere beruht auf DNA-Abschnitten, die spezifische Basensequenzen aufweisen.

 

Bis zum Jahr 1975 war es praktisch unmöglich, die Basensequenz größerer DNA-Abschnitte oder gar vollständiger Genome zu bestimmen. Es gab nur sehr arbeits- und zeitaufwendige Verfahren, mit deren Hilfe für sehr kurze DNA-/RNA-Moleküle (bis etwa 100 Basen) die Basensequenz bestimmt werden konnte. Ein Durchbruch kam in den Jahren 1975 bis 1978 mit der Entwicklung zweier völlig neuer Sequenzierverfahren, die mit einem Schlag die Sequenziergeschwindigkeit um mehrere Größenordnungen erhöht und die Kosten und den Aufwand entsprechend gesenkt haben. Die eine Methode ist die chemische Sequenzierung, die von den amerikanischen Forschern Allan M. Maxam und Walter Gilbert entwickelt wurde. Das andere Verfahren, auch die enzymatische Sequenzierung genannt, hat Frederic Sanger aus England erdacht und realisiert. Walter Gilbert und Frederic Sanger haben 1980 gemeinsam den Nobelpreis für Chemie für ihre Arbeiten auf dem Gebiet der DNA-Sequenzierung erhalten. Die Verleihung des Nobelpreises für die Entwicklung einer Methode, und zwar schon wenige Jahre nach der Veröffentlichung, zeigt, wie wichtig diese Verfahren für die Wissenschaft und ganz besonders für die Entwicklung der Gentechnologie tatsächlich sind.

 

Es ist daher nicht verwunderlich, dass die Entwicklung der DNA-Sequenzierungstechniken parallel zur Gentechnologie verlaufen ist. Die Gründe dafür liegen auf der Hand: Mithilfe der Genklonierung ist es möglich geworden, Gene oder andere beliebige DNA-Abschnitte in großer Menge und hervorragender Reinheit mithilfe von Bakterien zu produzieren. Erst solcherart gereinigte Gene machten eine Bestimmung der Basensequenz möglich. Vor der Erfindung der Genklonierung war es schlicht unmöglich — von Ausnahmefällen einmal abgesehen — überhaupt genügend reines Genmaterial zu gewinnen, um damit eine Sequenzierreaktion durchführen zu können.

 

Andererseits hat die Entwicklung der schnellen Sequenziermethoden wiederum einen stark beschleunigenden Effekt auf die Weiterentwicklung der Gentechnologie als Ganzes gehabt. Die Kenntnis der Basensequenz eines DNA-Moleküls ist für den Gentechnologen genauso wichtig wie für einen Straßenbauer die Landkarte oder wie für einen Schriftsteller die Bedeutung der Buchstaben und Worte einer Sprache. Die Entwicklung der Sequenziertechnik ist, wie wir weiter unten sehen werden, inzwischen so weit fortgeschritten und zum Teil sogar automatisiert, dass die Bestimmung der Basensequenz aller menschlichen Gene inklusive der zwischen den Genen liegenden Abschnitte in wenigen Jahren durchaus erreichbar scheint.

 

 Die Maxam-Gilbert-Methode (chemische Sequenzierung)

 

Die chemische DNA-Sequenzierung nach Allan M. Maxam und Walter Gilbert beruht auf der basenspezifischen Spaltung eines DNA-Moleküls mit verschiedenen chemischen Reagenzien. Diese reagieren jeweils bevorzugt mit bestimmten Basen und zerstören dadurch die jeweilige(n) Base(n). Eine zerstörte Base ist ein Schwachpunkt in der Polynukleotidkette. An einer solchen Stelle kann das DNA-Molekül leicht gespalten werden, beispielsweise durch eine Behandlung mit einer heißen Piperidinlösung. Praktisch passiert bei der chemischen Sequenzierung Folgendes: Als Ausgangsmaterial muss eine hochreine DNA-Lösung, die ausschließlich eine einzige Molekülfraktion enthält, hergestellt werden. Dies geschieht durch Genklonierung mit anschließender Verdauung mit einem Restriktionsenzym, das den zu sequenzierenden Abschnitt aus dem Gesamtmolekül herausschneidet. Die DNA-Moleküle werden anschließend an ihren Enden mit einem radioaktiven Phosphor- oder Schwefelatom markiert und die komplementären Stränge voneinander getrennt.

 

Die Markierung ist sehr wichtig, weil einerseits die DNA-Moleküle mithilfe dieser radioaktiven Markierung nach der Sequenzierungsreaktion nachgewiesen werden, andererseits diese Markierung aber auch benutzt wird, um von dieser Position aus die Position einer bestimmten Base zu messen.

 

Die chemische Sequenzierung ist eine schnelle und, was die Datenzuverlässigkeit angeht, sichere Methode. Aufgrund verschiedener Nachteile (unter anderem hoher Arbeitsaufwand, Einsatz von Krebs erregenden Substanzen) gegenüber der enzymatischen Sequenzierung ist die chemische Sequenzierung fast völlig aus den molekularbiologischen Laboratorien verschwunden und wird heute nur noch für spezielle Fragestellungen eingesetzt.

 

 Die Sanger-Methode (enzymatische Sequenzierung)

 

Die enzymatische Sequenzierung nach Frederick Sanger beruht auf der Kettenabbruchsynthese. Deren Prinzip liegt darin, in vitro — also im Reagenzglas — an einem DNA-Strang das komplementäre Molekül mithilfe eines DNA-Synthese-Enzyms (DNA-Polymerase) zu synthetisieren, dabei aber gezielt die Kettenverlängerung bei spezifischen Basen zu unterbrechen. Ähnlich wie bei dem Maxam-Gilbert-Verfahren wird die Position einer Base relativ zu einem definierten Molekülanfang bestimmt.

 

Der Molekülanfang bei der enzymatischen DNA-Sequenzierung wird durch den Primer festgelegt. Ein Primer ist ein relativ kurzes, einzelsträngiges DNA-Molekül, das komplementär zu einem Abschnitt des Matrizenstrangs ist und sich deshalb an diesen anlagern kann. Der Primer ist unbedingt für eine enzymkatalysierte DNA-Synthese notwendig, da alle DNA-Polymerasen nur eine vorhandene DNA-Kette verlängern, nicht aber die erste Base eines Strangs bereitstellen können.

 

Für die Kettenabbruchmethode nach Sanger wird der Primer so gewählt, dass er kurz vor dem eigentlich zu sequenzierenden DNA-Abschnitt an den Matrizenstrang bindet. Von diesem Primer aus kann dann eine hinzugefügte DNA-Polymerase die DNA-Kette verlängern, wobei die Nukleotide streng nach dem Komplementaritätsprinzip eingebaut werden.

 

Inzwischen gibt es für diesen Zweck nicht nur die natürlichen DNA-Polymerasen, sondern speziell mithilfe gentechnischer Verfahren optimierte Enzyme, die mit hoher Zuverlässigkeit die komplementären Basen einbauen.

 

Für die Sequenzierung kommt es nun darauf an, dass gelegentlich während der Synthese die Verlängerung der neu synthetisierten DNA-Kette basenspezifisch abgebrochen wird. Dadurch erhält man ähnlich wie bei der chemischen Sequenzierung in jeder der vier Sequenzierungsreaktionen eine Molekülschar, bei der alle Moleküle entweder bei G, A, C oder T — je nach Reaktionsgemisch — enden. Die Auswertung der aus der Kettenabbruchreaktion resultierenden DNA-Fragmente erfolgt wie bei der Maxam-Gilbert-Methode über eine hochauflösende Polyacrylamid-Gelelektrophorese. Mit diesem Trennverfahren ist es ohne weiteres möglich, DNA-Moleküle bis zu einer Länge von circa 1000 Basen so aufzutrennen, dass ein Längenunterschied von nur einer Base noch deutlich zu erkennen ist.

 

Diese Auftrennungsgenauigkeit ist notwendig, da die exakte Position der Base, bei der der Abbruch erfolgt ist, relativ zum Ende des Moleküls (= 5'-Ende des Primers) bestimmt werden muss.

 

Sowohl die Sanger-Methode als auch die Maxam-Gilbert-Methode erfordern erheblichen manuellen Einsatz und großes Geschick bei der Herstellung und Auswertung der Elektrophoresegele. Die Sanger-Methode war viele Jahre das dominierende Sequenzierverfahren, weil es sehr viel einfacher und schneller durchgeführt werden konnte als die Maxam-Gilbert-Technik. Seit einigen Jahren verschwindet nun auch die klassische Sanger-Sequenzierung und wird abgelöst durch die automatische oder Online-Sequenzierung, die im Grunde genommen aber nur eine Modifikation der enzymatischen Sequenziertechnik nach Sanger ist.

 

 Die automatische oder Online-Sequenzierung

 

Obwohl die Einführung der beiden revolutionären DNA-Sequenzierungsverfahren in den Jahren 1975—1978 die Entwicklung der Gentechnik bereits erheblich beschleunigte, war der Wunsch nach noch schnelleren und vor allem weniger arbeitsaufwendigen Sequenzierungsverfahren unter den Molekulargenetikern und Gentechnologen sehr groß. Es war zwar mit dem schnellen Sanger-Verfahren möglich, beispielsweise ganze Virengenome zu sequenzieren, die immerhin eine Länge von bis zu zweihunderttausend Basen aufwiesen, die vollständige Sequenzierung ganzer Bakterien- oder gar Tier- und Pflanzengenome schien jedoch unmöglich oder war nur mit enormem personellen und finanziellen Aufwand denkbar. Eine Sequenzierung des menschlichen Genoms mit rund drei Milliarden Basenpaaren war für viele Forscher unvorstellbar.

 

Im Jahre 1980 war ein in den Sequenziertechniken erfahrener Wissenschaftler in der Lage, etwa tausend Basen pro Tag zu sequenzieren. Das kleinste Bakteriengenom hat eine Größe von etwa einer Million Basenpaaren, was bedeutet, dass ein Forscher mehrere Tausend Arbeitstage gebraucht hätte, um etwa ein Bakteriengenom vollständig alleine zu sequenzieren. Bei einer durchschnittlichen Zahl an Arbeitstagen von rund 220 pro Jahr wäre ein Forscher mit einem solchen Projekt mehr als zehn Jahre beschäftigt gewesen. Noch viel hoffnungsloser wäre das Humangenomprojekt, die Aufklärung der Basensequenz des menschlichen Genoms gewesen: Der Mensch hat ein Genom von circa drei Milliarden Basenpaaren, und damit wären im Jahre 1980 mit der seinerzeit verfügbaren Sequenziertechnologie 300 Forscher mindestens 100 Jahre beschäftigt gewesen, um die Sequenz des menschlichen Genoms zu entschlüsseln — selbst für Wissenschaftler mit Visionen eine unmögliche Vorstellung!

 

Trotzdem ist es innerhalb der letzten 15 Jahre möglich geworden, ganze Bakteriengenome und sogar die DNA von komplexen Eukaryoten (Bäckerhefe, Fadenwurm) vollständig zu sequenzieren. Die Sequenzierung des Genoms der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae war ein weltweit koordiniertes Projekt, an dem mehr als 80 verschiedene Laboratorien in der ganzen Welt mit mehreren Hundert Mitarbeitern beteiligt waren. Circa 12,5 Millionen Basen mussten sequenziert werden, wobei nach und nach immer mehr die automatischen oder Online-Sequenzierverfahren eingesetzt wurden.

 

Die verfügbaren Online-Verfahren beruhen auf zwei wichtigen Änderungen gegenüber dem klassischen Sanger-Verfahren: Einerseits werden neue Markierungstechniken eingesetzt, bei denen Fluoreszenzfarbstoffe an die DNA oder einzelne Basen gekoppelt werden. Anderseits erfolgt die Auswertung nicht mehr von Hand durch einen Wissenschaftler, sondern das Ergebnis der Sequenzierung wird mithilfe einer Laser-/Photomultiplier-Einrichtung automatisch (online) in einen Computer eingelesen, der dann unter Umständen auch noch eine weitgehend automatisierte Auswertung der DNA-Sequenzen vornimmt. Zurzeit gibt es drei verschiedene Online-Verfahren, die sich nur graduell voneinander unterscheiden. Bei allen drei Verfahren erfolgt die eigentliche Sequenzierreaktion nach der Kettenabbruchmethode nach Sanger. Ebenfalls gemeinsam für alle drei Verfahren ist die Auftrennung der Produkte der Sequenzierreaktion durch Polyacrylamidgelelektrophorese. In allen drei Verfahren wird die DNA mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert, sodass mithilfe einer Laserlichtquelle die DNA-Fragmente zum Leuchten gebracht werden. Diese Fluoreszenz wiederum wird von einer Photozelle gemessen und so das Ergebnis der elektrophoretischen Auftrennung online in einen Computer übermittelt.

 

Die modernen Online-Sequenziergeräte besitzen eine Sequenzierkapazität, die pro Maschine in einer Nacht bis zu 60 000 Basenpaare und mehr an Rohdaten liefern. Die Einführung einer neuen Elektrophoresetechnik, der Kapillarelektrophorese, die die notwendigen Laufzeiten des Elektrophoreseschritts auf weniger als ein Zehntel der bisherigen Verfahren senkt, erhöht die Kapazität der Sequenzierautomaten auf das Sechs- bis Achtfache, sodass eine einzige Maschine pro 24 Stunden 400 000 bis 500 000 Basen Rohdaten wird liefern können. Hinzu kommt, dass mehr und mehr auch die der eigentlichen Sequenzierung vorgeschalteten Arbeitsschritte automatisiert und durch Roboter übernommen werden. Dies erhöht die Kapazität und senkt die Kosten.

 

 Sequenzierungsstrategien

 

Die Technik bringt es mit sich, dass nur relativ kurze DNA-Fragmente bis zu etwa 1000 Basen Länge direkt mit einer Sequenzierungsreaktion bestimmt werden können. Für längere DNA-Moleküle müssen spezielle Sequenzierungsstrategien entwickelt werden. Die einfachste und auch am häufigsten angewandte Strategie ist das Random-Sequencing, das zufällige Sequenzieren.

 

Die Idee hinter dieser Strategie ist, dass man etwa wie beim Roulettespiel die Kugel nur oft genug werfen muss, um alle Zahlen zu treffen. Bei der Zufallsstrategie wird ein großes DNA-Molekül, etwa ein ganzes Bakteriengenom mit DNA brechenden Verfahren (wie Behandlung mit Ultraschall; Pressen durch eine sehr enge Öffnung, Behandlung mit unspezifisch DNA spaltenden Enzymen und so weiter) in viele zufällig kleine Stücke zerlegt. Diese vielen kleinen Stücke werden anschließend in Vektoren kloniert, die eine leichte DNA-Sequenzierung erlauben. Es wird eine DNA-Zufallsbibliothek angelegt. Aus dieser Zufallsbibliothek werden dann DNA-Klone herausgenommen und deren Sequenz ermittelt. Die erhaltenen Sequenzen werden in einer Computerdatenbank gesammelt. Der Computer vergleicht alle eingehenden Sequenzen daraufhin, ob diese Sequenzen oder Teile davon bereits in der Datenbank vorhanden sind oder nicht. Sind Übereinstimmungen vorhanden, so schreibt der Computer die überlappenden Bereiche untereinander und hängt diese Sequenzen zu einem kontinuierlichen Molekül zusammen. Je mehr Klone aus der Zufallsbibliothek sequenziert werden, umso höher wird die Trefferquote und umso stärker wachsen die Einzelsequenzen zu langen, kontinuierlichen Strecken zusammen. Natürlich werden dabei viele Abschnitte mehrfach sequenziert. Es hat sich aber erstaunlicherweise herausgestellt, dass diese Zufallsstrategie tatsächlich den meisten anderen Strategien in Schnelligkeit überlegen ist. Durch die relativ hohe Redundanz ist die Strategie möglicherweise nicht die preiswerteste, sie lässt sich aber mit Sicherheit am einfachsten vollständig automatisieren. Bis auf die Herstellung der Zufallsbibliothek werden bei dieser Strategie immer nur die gleichen Schritte wiederholt, bis das Computerprogramm alle Fragmente zu einem einzigen Molekül zusammengesetzt hat und keine neuen Sequenzen durch Sequenzierungen weiterer Klone mehr hinzukommen. Es ist erstaunlich zu sehen, wie effizient eine intellektuell sicher nicht sehr anspruchsvolle Strategie zu dem gewünschten ergebnis führt.

 

Neben der Zufallsstrategie gibt es eine Reihe zielgerichteter Vorgehensweisen, von denen hier nur die Primer-Walking-Strategie (Primer-Wanderung) erklärt werden soll. Dabei wandert man mit den aufeinander folgenden Sequenzierreaktionen an dem DNA-Molekül Schritt für Schritt entlang. Nachdem eine Sequenzierreaktion erfolgreich abgeschlossen ist, wird am Ende der erhaltenen Sequenz von rund 500 Basen ein Abschnitt ausgewählt, zu dem eine kurze, 18 bis 20 Basen lange komplementäre Sequenz synthetisch hergestellt wird. Dieses kurze Molekül wird in der folgenden Sequenzierreaktion als Primer eingesetzt, um damit wiederum eine Strecke von etwa 500 Basen zu sequenzieren.

 

Der Vorteil des Primer-Wanderns liegt einerseits darin, dass jeder Abschnitt nur ein- bis zweimal sequenziert werden muss und dass andererseits bei jedem Sequenzierschritt klar ist, wo auf dem großen Ausgangs-DNA-Molekül die gerade bestimmte Basensequenz lokalisiert ist. Dies ist vor allem dann von einem erheblichen Vorteil, wenn eine zu sequenzierende DNA oder ein Genom repetitive Sequenzen enthält. Repetitive Sequenzen sind DNA-Abschnitte, die in einem Genom in identischer oder leicht veränderter Form mehrfach und an unterschiedlicher Stelle vorkommen. Solche repetitiven Sequenzen können ein unüberwindliches Hindernis bei der Zufallsstrategie sein. Der Grund dafür liegt auf der Hand: ein Computerprogramm ist selbstverständlich nicht in der Lage, identische Sequenzabschnitte als verschieden zu erkennen, was letztlich nur durch Lageinformation möglich ist. Diese Lageinformation ist aber gerade durch die Zerstückelung für die Herstellung der Zufalls-DNA-Bibliothek zerstört worden. Für Genome mit einem hohen Anteil an repetitiven Sequenzen wie das menschliche Genom, eignet sich eine reine Zufallsstrategie nur bedingt. In den meisten Fällen wird hier eine Mischung aus Zufalls- und gerichteter Strategie zum Erfolg führen.

 

Prof. Dr. Erwin Schmidt

 

Weiterführende Erläuterungen finden Sie auch unter:

 

Gentechnik: DNA-Synthese und PCR

 

Grundlegende Informationen finden Sie unter:

 

Gentechnik: Klonierung von Genen

 

Literatur:

 

Alphey, Luke: DNA-Sequenzierung. Aus dem Englischen. Heidelberg u. a. 1998.

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Das Genom-Puzzle. Forscher auf der Spur der Erbanlagen, herausgegeben von Hilke Stamatiadis-Smidt u. a. Berlin u. a. 1998

 

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Gentechnische Methoden. Eine Sammlung von Arbeitsanleitungen für das molekularbiologische Labor, herausgegeben von Hans Günter Gassen und Gangolf Schrimpf. Heidelberg u. a. ²1999.

 Glick, Bernard R. / Pasternak, Jack J.: Molekulare Biotechnologie. Aus dem Englischen. Heidelberg u. a. 1995.

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